高效液相色譜儀在進行多成分的復雜樣品分離時，經常會碰到前面的一些成分分離不*，后面的一些成分分離度太大，且出峰很晚和峰形較差。為了使保留值相差很大的多種成分在合理的時間內全部洗脫并相互分離，往往要用到梯度洗脫技術。
在高效液相色譜儀中流速（壓力）梯度洗脫和溫度梯度洗脫效果不大，而且會帶來一些不利影響，因此，高效液相色譜儀中的梯度洗脫通常指流動相梯度洗脫，即在分離過程中改變流動相的組成或濃度。
高效液相色譜儀梯度洗脫系統也稱為梯度洗脫或程序洗脫。在相同的分析周期中，流動相的濃度比按一定的步驟不斷變化，稱為梯度洗脫。原理：流動相由幾種不同極性的溶劑組成。通過改變流動相中溶劑的比例和改變流動相的極性，每個組分都有一個合適的容量系數k，樣品中的所有組分都能在最短的時間內達到最佳的分離特性：提高柱效率和提高分離效率。檢測靈敏度。敏感。當樣品中某一峰的k‘值比上一峰高出幾十至數百倍時，梯度洗脫效果特別好。在梯度洗脫過程中，必須采用恒流泵來保證流速的穩定性，否則很難得到重復的結果。
高效梯度液相色譜儀進行梯度洗脫時，選定溶劑A、B之后，設定梯度速度和梯度時間，確定梯度曲線形狀，要以經濟的梯度洗脫程序，實現樣品的最佳化分離。影響梯度洗脫的因素有：
1、溶劑的純度要高，否則會使梯度洗脫的重現性變壞。
2、梯度混合的溶劑互溶性要好，應防止不互溶的溶劑進入色譜柱。
3、注意溶劑的粘度和密度對混合流動相組成的影響。
4、梯度洗脫應使用對流動相組成變化不敏感的選擇型檢測器，而不能使用對流動相組成變化敏感的通用型檢測器。
